qq名字网阿贝成像原理
细胞内超微结构及其动态变化一直都是生物学研究中的重要内容，自16世纪末期简易显微镜的出现，到1665年R·Hooke（罗伯特·虎克）用复合式显微镜观察软木塞的薄切片，发现并命名了cell（细胞），再到1674年，荷兰显微镜学家Antoni van Leeuwenhoek（列文虎克）用自制显微镜首次发现了微生物，随后三个多世纪以来，光学显微成像技术经历了从普通的明场显微镜到荧光显微镜，并进一步发展到激光共聚焦显微镜、双光子显微镜、超分辨率显微镜等不同成像技术，推动生物学研究进入了崭新的时代。
艾里斑（Airy Pattern）与分辨率（Resolution）————————————
2014年诺贝尔化学奖授予了美国科学家Eric Betzig（埃里克·白兹格），美国科学家William E. Moerner（威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔）和德国科学家Stefan W. Hell（斯特凡·W·赫尔），以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。
图1. 2014年诺贝尔化学奖（图片来自网络）
颁奖词中表示：“光学显微成像技术的最高分辨率一直无法超过发射光波长的一半，但是借助荧光分子的帮助，这三位科学家开创性的贡献使得光学显微成像技术的分辨极限拓展到了纳米尺度”。其中提到的“分辨极限”，正是表征显微系统分辨细节能力的重要指标——分辨率（Resolution），一般被定义为能被显微镜清晰区分的相邻两个物点的像之间的最小距离。
按照几何光学理论，当没有像差时，每个物点Q应该产生一个锐的像点Q’，见下图所示：
图2. 理想光具组的几何光学成像（图片来自中国科学院大学《细胞成像技术》课程罗志勇老师“显微镜基础”课件）
然而，由于光的衍射效应，物点实际成的像总是一个有限大小的光斑——1835年英国皇家天文学家乔治·比德尔·艾里（George Biddell Airy）【1】将之命名为“艾里斑”（一个无限小的发光点在通过具有有限孔径的圆形透镜系统后，由于光的衍射特性，光强分布会形成一个弥散的斑状像，被称为“艾里斑”，如图3所示），也被称为成像系统的点扩散函数（Point-Spread Function，PSF）。试想，如果两个物点距离较近，致使两者的像斑发生重叠，那么两个像斑中心靠得越近，就越难被区分出是两个像点。
图3. 艾里斑顶视图（左图）与侧视图（右图）显示中央主极大亮斑和衍射环【1】
1896年，英国物理学家瑞利勋爵三世（John William Strutt）提出了瑞利判据（The Rayleigh Criterion）：当一个艾里斑的中心点与另一个艾里斑的第一级衍射暗环重合时，刚好能被分辨出是两个艾里斑（图4所示）。
图4.瑞利判据定义的分辨率极限，左：可被明确区分的两个艾里斑，中：瑞利判据定义的刚好可被区分的两个艾里斑，右：不可被区分的两个艾里斑【1】
同时，也给出了基于圆形透镜组（例如：光学物镜）的光学成像系统的分辨率计算公式：d= 0.61λ/NA（即：圆孔衍射的一阶暗衍射条纹所在的位置）。其中，λ为发射光波长，NA（Numerical Aperture）=n*sinθ,为一个光学物镜的“数值孔径”，其中n为光路介质的折射率，θ为物镜聚焦光锥（light cone）的半角。瑞利判据揭示了远场光学显微镜在光的衍射效应和光学系统有限孔径的制约下，分辨率受限于发射光波长λ与成像系统的数值孔径NA。
长久以来，为了提高光学显微镜的分辨率，早期的研究工作往往集中在如何减小艾里斑的尺寸，包括减小照明光的波长、增大物镜数值孔径等。然而，荧光成像系统所用的照明光为可见光，其波长范围为400-700nm，目前光学物镜的NA值最高所能达到的值为1.7，因此能被显微镜清晰区分的相邻两个物点的像之间的最小距离约为200nm。而现代科学研究对于生命体系的认识已经深入到单细胞、单分子水平, 因此迫切需要在分子水平上对亚细胞结构及生物大分子（尺寸在百纳米以下）的动态行为进行实时观测和分析。
单分子定位（Single Molecular Localization）————————————
1989年，William E. Moerner（威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔）在超低温下首次实现了单个分子的吸收光谱测量【2】；1995年，Eric Betzig首次提出如果能够利用任意光学性质（例如：光谱、偏振、寿命等）将每一个单一分子孤立出来，从而准确测量其位置信息，那么即可获得超分辨图像【3】。1997年，William E. Moerner与凭借绿色荧光蛋白获得2008年诺贝尔化学奖的Tsien RY（钱永健）合作发现了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的光开关闪烁转化效应（On/off blinking and switching）【4】（GFP在488nm的光照下会发射荧光并进入暗态（OFF）不再发光，但是已经进入暗态的GFP分子可以被405nm的激光激活（ON），激活后的GFP分子可以再次被488nm激光激发并发出荧光）；2006年，Eric Betzig等人实现了基于光活化（Photo-Activation）/光转换（Photo-Convertible）荧光分子的“（荧光）光敏定位成像技术”Photo-Activated Localization Microscopy, PALM）【5，6】：通过融合蛋白实现对样品的高密度荧光标记，之后使用激活光（405nm）使少数目的荧光蛋白进入亮态（可以被561nm激光激发发光的状态）。因为这个激活过程是随机的，所以被激活的荧光蛋白分布稀疏而离散，从而可以实现离散的、单个的分子定位。而这些被激活的荧光蛋白被561nm激发并发光成像后会再次进入暗态，接下来再通过405nm激光激活另一批荧光蛋白进行下一轮稀疏的单分子定位成像。如此多次反复，就可以将样品中高密度的荧光分子逐一定位，最后再把多张定位图片叠加，即可获得一幅单分子定位精度极高的超分辨率图像（图5），其定位精度可达2-25nm。
图5.光敏定位成像技术原理（荧光成像图A-F及其对应的单分子定位拟合图A’-F’，其中，A为目标区域光激活前的荧光成像，B为被405nm激光激活后的荧光分子成像，C为被561nm激光持续激发直到B图中被激活的荧光分子大量淬灭并进入暗态的成像图，D为第二轮405nm激光激活后的成像图，E为多轮激活图像的叠加图，F为E图的局部放大）【5】
同年，哈佛大学庄小威（Xiaowei Zhuang）研究组也发表了基于荧光染料单分子定位的“随机光学重构成像技术”（STochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）【7】。他们报道了一系列“激活子-报告子染料对”（Activator-Reporter Pairs）【8】，以Cy3-Cy5染料对为例说明： Cy5分子可以在633nm激光的照射下发射荧光并进入暗态，之后可以被532nm激光激活从暗态转化为亮态并可以再次发光，而其激活效率受控于另一个染料分子Cy3。PALM和STORM在原理上都是基于荧光分子的光开关能力实现单个荧光分子的定位，从而把荧光成像的分辨率推进到了约20nm。随后，庄小威课题组又先后实现了多色、三维（3D）单分子定位超分辨技术，并在各种细胞生物学研究领域进行应用（见图6）【9】。
图6.双色3D STROM技术应用于细胞内线粒体（紫色）与微管（绿色）成像观察（a目标区域宽场荧光成像，b目标区域3D STORM成像，c-e目标区域局部放大的单层光学切片宽场、STROM成像，以及横切、纵切视图）【8】
受激辐射损耗（STimulated Emission Depletion）————————————
基于抑制点扩散函数中心点之外的地方发出荧光的点扫描“受激辐射损耗成像技术”（STimulated Emission Depletion, STED），及其衍生“可逆饱和光学荧光转化成像技术”（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions，RESOLFT），以及并行扫描（Parallelized scanning RESOLFT）技术【10】是德国科学家Stefan W. Hell（斯特凡·W·赫尔）提出并发展的另一种实现超分辨成像的思路，他们利用荧光分子的受激辐射效应，将一个高强度的耗损光调制成面包圈形状（图7a中红色圈状图形），并与激发光束中心准直，之后将两束光一起照射到样品上。被照射的区域中处于基态的荧光分子被激发光激发，并跃迁到激发态后，在外围面包圈状损耗光的照射下，原本处于激发态的荧光分子将以受激辐射方式直接回到基态而不再发射特定波长的荧光，位于激发光斑中心没有被耗损光照射到的荧光分子则不受损耗光影响，继续发射荧光后跃迁回基态（图7a中黄色五角星）。通过这种方法，成像区域荧光分子的实际发光面积得以减小，即缩小了成像系统实际艾里斑的尺寸，从而达到了提高系统的分辨率的目的。
图7.几种超分辨成像技术的原理：a基于面包圈状耗损光照明光圈坐标定位激活目标分子的STED、RESOLFT点扫描和并行扫描成像原理，b基于随机单分子激活定位的PALM，STORM，GSDIM，PAINT的宽场照明成像原理，c结合光敏蛋白光开关特性的面包圈定位激活目标分子的MINFLUX成像技术原理，d荧光分子亮态（on）与暗态（off）的标识说明【11】
这些新型成像技术“打破”了曾被认为是不可逾越的光学衍射极限，可达到百纳米、甚至十几纳米的光学分辨率，故被称为“超分辨成像技术”（Super-resolution Microscopy）。而自问世以来，超分辨成像技术在观察和发现新的细胞超微结构、功能等方面已经成为了不可或缺的利器（图8）。
图8.超分辨显微成像技术在细胞生物学研究中的应用：a.染色质超微结构，b.核孔复合体，c.胞质核糖体，d.囊泡，e.过氧化物酶体，f.黏着斑,g.高尔基复合体，h.细胞骨架结构，i.内质网，j.线粒体超微结构,k.溶酶体，l.中心体【10】
衍射极限（Diffraction limit）与傅里叶光学（Fourier Optics）————————————
早在1873年，德国科学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）就已经提出了基于完美相干照明的显微成像理论：入射光经物平面发生远场衍射（即“夫琅禾费衍射”），在透镜焦面上形成一系列衍射光斑，各衍射光斑发出的球面次波在像面上相干叠加形成像。物平面上的每一个点都可以被认为是一个相干次级波动中心，这些次级光源传递出去的光波将互相发生干涉。如果我们能采集到全部的次级波并最终汇聚到像平面处，那么我们将得到一个细节清晰、真实的、放大的像【12】。这一过程中，成像系统的点扩散函数（Point-Spread Function，PSF）可以用贝塞尔函数或者高斯函数来模拟，而物体在透镜后焦面（频谱面）上得到的衍射图形是物平面图像的傅里叶变换频谱图（见图9所示），等效于点扩散函数的傅里叶变换——光学传递函数（Optical Transfer Function，OTF）。
图9.透镜的傅里叶变换性质（上图：阿贝成像理论，下图：阿贝-波特实验解释汇聚透镜的本领——二维傅里叶变换）
（图片来自中国科学技术大学姚焜老师大学物理实验讲座《傅里叶光学和光学信息处理》网络课件）
上图告诉我们，透镜的汇聚原理是进行一次准确的傅里叶变换（Fourier transform，FT），其反过程则被称为反傅里叶变换（inverse FT）。然而，由于光学物镜孔径（NA）是有限的，因此光学成像系统并不能保证焦平面所有次级频谱都可以最终参与成像，而如果那些被丢失掉的频谱中携有可观能量的谱（即：精细结构），那么最终成的像中将会出现模糊、虚假的细节（见图10中low object成像效果图）。因此，具有一定数值孔径的光学物镜所能通过（接收）的最高空间频率为k0=1/d，其中d为阿贝光学衍射极限λ/2NA，而空间频率超过k0的高频信息将无法被成像系统采集到（故k0也被称为截止频率“cut-off frequency”，见图10中虚线圈所示范围），即光学系统存在衍射极限（Diffraction limit）。
图10.实空间（real space）与倒空间（reciprocal space傅里叶空间）的对应关系【13】
因此，从傅里叶光学角度看来，光学成像系统也被称为低通滤波器（仅允许空间频率低于成像系统截止频率的信号通过）。试想，如果光学系统能尽可能多地接收到更高空间频率的样品信息，那么也能更大限度地还原样品的高分辨率细节信息，从而达到突破衍射极限的目的。
结构光照明超高分辨显微成像技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）————————————
结构光照明成像技术便是基于傅里叶光学原理发展起来的超分辨成像技术。脉冲响应函数( δ函数)可使与其卷积的函数发生空间频率的平移，即具有移频特性。而余弦函数的频谱分布恰为三个δ函数，光学成像是照明光与物卷积的过程，因此，在实空间对物体加载（照射）满足余弦函数分布的结构光，即可实现倒空间对衍射极限外高频信息的搬运（详见图11-13所示）。
图11.结构光照明移频原理：a对物体加载（照射）满足余弦函数分布的结构光后在实空间产生的莫尔条纹，b显微系统所能接收到的空间频率范围（半径为截止频率k0），c 余弦函数空间频率分布（三个衍射点），d余弦函数分布的结构光与物体空间频率（OTF）卷积实现移频，e 通过变换结构光方向实现三个角度的移频【14】
图12.结构光照明倒空间高频信息重构原理：a宽场照明成像所获得图像的傅里叶变换频谱图，b结构光照明移频后的傅里叶变换频谱图（箭头指示成像系统捕获了额外的高频信息），c通过三个角度、每个角度变换三个相位的结构光照明获得了七张到九张包含不同频率信息的原始数据，d 通过移频合并获得了远超过图a截止频率范围的更多高频信息的倒空间频谱图，即突破光学系统的衍射极限获得了更高空间频率的样品信息【14】
图13.结构光照明成像效果：a海拉细胞内微丝结构的宽场照明成像，b海拉细胞内微丝结构的结构光照明成像，c-d图a-b黑框区域的局部放大图【14】
Gustafsson MG率先提出了结构光照明成像技术的概念，并于2000年发表了其在细胞生物学中的应用【14】以及三维结构光照明超分辨成像技术【15】，他们通过线性结构光照明成像技术将横向空间分辨率提升至100nm 左右，纵向分辨率提升到了280nm，并随后又提出了非线性结构光照明（Nonlinear SIM，NL SIM）的概念【16,17】，通过控制照明光模式，使得荧光和照明光不再符合线性关系，产生具备更高阶空间频率的结构光场，从而使横向空间分辨率进一步提高到了40 nm，但相对应的信息重构所需的原始图像也从9张增加到了45张（图14）。
图14.非线性结构光照明成像原理：a显微系统所能接收到的空间频率范围（半径为截止频率k0），b对物体加载的饱和激发照明光栅，c 非线性照明光空间频率分布（包含更多高频衍射点），d非线性结构光与物体空间频率（OTF）卷积实现移频，e 通过变换结构光方向实现十二个角度的移频【16】
相比于其他超分辨成像技术，结构光照明成像技术（SIM）具备成像速度快（时间分辨率高）、光毒性小（辐照密度低）等特点，且百纳米的分辨率正好满足细胞内重要细胞器的观察需求，故而被称为最适合活细胞成像的超分辨显微成像技术，近年来受到广泛重视。
在重构伪迹优化算法方面，华中科技大学谭山课题组和北京大学陈良怡课题组联合开发了基于海森矩阵（Hessian matrixes）卷积算法的“海森结构光照明成像技术”（Hessian-SIM）【18】，利用生物样本在空间的连续性作为先验知识来重构SIM图像，与维纳反卷积这个经典的重构算法相比，海森反卷积只需要百分之十的光子数就可以达到同样的重构效果（无明显伪迹），从而大大降低了照明光辐照密度（低至8~250
W/cm2），在188Hz的高时间分辨率下获得了88nm的横向分辨率。在照明模式优化方面，Eric Betzig等提出了“贝塞尔光片结构光照明成像技术”（Bessel Light-sheet SIM）【19，20】，利用贝塞尔光片照明光路仅对在焦面的荧光分子进行激发成像，有效减少了非焦面荧光分子的发光，从而大大提升了图像信噪比，也有效降低了三维成像过程中对样品的辐照总剂量，然而受限于贝塞尔光路产生原理，成像物镜的NA值被限制在1.1，故其空间分辨率有所下降。2018年，中科院生物物理研究所李栋课题组提出了“掠射结构光照明成像”（Grazing incidence SIM，GI-SIM）【21】的概念，通过精准控制照明光在物镜后口的特定入射角度，实现掠射（Grazing incidence）照明产生一个厚度与物镜景深相匹配的照明光片，实现了最优的二维超分辨成像条件。该技术结合了光片照明对样本的低光漂白及低光毒性特征，且可使用高数值孔径的物镜成像，而微米级的入射深度同时又弥补了二维超分辨成像技术（例：全内反射结构光照明成像技术TIRF-SIM）无法实现胞内成像的不足。这些优化方案的提出使结构光照明成像的时间分辨率大幅增加到了266fps，成像深度被提升到了微米级别，为多维度生命现象的动态研究提供了强有力的观察手段。
小结————
上文提到的这些重要的超分辨成像技术突破衍射极限的原理不尽相同且各具特色，下表（表1）归纳了这些成像技术的原理、分辨率、辐照密度和荧光标记基团的要求，也是对本文主要内容的总结。
表1.对几种超分辨显微成像技术的原理、分辨率、辐照密度和荧光标记基团要求的总结
致谢
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特别感谢生物成像中心李栋研究员、孙飞研究员以及滕岩高级工程师在本文撰写过程中给予的指导与帮助。
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======作者小档案======
李硕果工程师，本科毕业于广西民族大学物理学专业，硕士毕业于四川农业大学生物物理学专业，现在中科院生物物理研究所生物成像中心任超分辨荧光成像技术工程师，研究方向为：超分辨荧光成像技术应用、冷冻光电关联成像新技术新方法研究。
