qq名字网革兰氏染色原理
书接上文(革兰氏染色技术——由来)。革兰氏染色虽然在1884年就已经提出，但关于其染色机制一直是个谜。你了解革兰氏染色机制吗？教科书上的机制是正确的吗？
染色流程及结果
一般来说，革兰氏染色的基本流程包括：①细菌涂片，微火干燥；②草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗；③碘液媒染1-2min，水洗；④95%乙醇脱色；⑤沙黄复染1-2min，水洗，擦干后显微镜镜检。革兰氏阳性菌显紫色，而革兰氏阴性菌显红色。
图1 革兰氏染色流程
细胞壁组分差异
要想了解染色机制，必须先大概了解一下微生物的细胞壁。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁成分区别很大，表1和图2对其进行了总结。总的来说，革兰氏阳性菌细胞壁厚而简单，主要成分是肽聚糖和磷壁酸，革兰氏阴性菌细胞壁薄而复杂，有一层薄薄的肽聚糖层，肽聚糖之外形成了外膜结构，主要成分是多糖、磷脂和蛋白。
表1 革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分
占干细胞比重
阳性菌
阴性菌
肽聚糖
很高~90%
很低5~20%
磷壁酸
较高<30%
0
脂质
一般无<2%
较高~20%
蛋白质
0~少量
较高
图2 革兰氏阳性和阴性菌细胞壁结构示意图
广为人知的染色机制
虽然革兰氏染色技术已经全球通用，效果杠杠的，但大家都是只知其然不知其所以然。终于，在革兰氏染色技术诞辰100年之际，一份大礼姗姗来迟。
1983年4月11日，来自于同一合作团队的两篇文章投稿到著名的细菌学杂志Journal of Bacteriology，两个月后同时接受，主要作者是加拿大学者Beveridge和美国学者Davies。
他们将I-KI换成K[PtCl3(C2H4)]，结晶紫(CV)同样能与其反生成CV-TPt沉淀，该沉淀和CV-I复合物性质类似，可用来模拟染色过程，利用STEM和EDS分析复合物即可实现其定位。利用该方法对枯草芽孢Bacillus subtilis和大肠杆菌Escherichia coli进行进一步研究。对于Bacillus subtilis，细胞外和细胞内都生成了沉淀复合物，乙醇会溶解胞外沉淀而不去处胞内沉淀。这是为啥呢(正常CV-I复合物是能被乙醇溶解的)？原因可能是乙醇会取代或减少细胞壁中水分含量，使得肽聚糖层更为紧密，抑制了染料复合物的外排。对于Escherichia coli，乙醇会直接破坏细胞壁的外膜结构导致外膜消失，乙醇会进一步与肽聚糖层和细胞膜反应，使其产生一些小的孔洞，这样被破坏的且势单力薄的肽聚糖层就阻挡不了CV-I复合物的逸出，从而乙醇脱色后细胞就是无色的了。
图3 乙醇脱色之后Bacillus subtilis(上)和Escherichia coli(下)的细胞变化
总结上述机制就是：结晶紫和碘液结合在细胞壁内形成CV-I复合物，革兰氏阳性菌细胞壁厚，肽聚糖层次多交联致密，且不含类脂，在乙醇脱水时因失水导致网孔缩小，因此能把复合物固定于细胞壁内，从而细菌呈现复合物的紫色；而革兰氏阴性菌细胞壁薄，肽聚糖层次少交联度低，且外膜中脂类物质含量高，在乙醇脱水时外膜溶解，薄薄的肽聚糖层不能阻挡复合物的溶出，因此细菌呈现复染染料沙黄的红色。
染色机制新解：教科书上的是对的吗？
经典染色机制早已写进各大教科书，其中核心的一个内容是，结晶紫和碘液会穿过细胞壁和细胞膜，在细胞内外都发生反应生成沉淀。事实，真的是这样吗？
2015年，ACS Chemical Biology上一篇文章挑战了经典机制。作者利用二次谐波散射和亮场透射电镜技术对大肠杆菌染色过程进行了实时监控。实验结果显示，结晶紫会容易穿透细胞壁外膜，但在肽聚糖层移动速率很慢，根本没有穿过细胞膜。在革兰氏染色的这个时间尺度内，生成的CV-I复合物只存在于肽聚糖层，由于革兰氏阴性和阳性菌肽聚糖层厚度差异较大，阴性菌肽聚糖层被破坏严重，CV-I复合物逸出，而阳性菌肽聚糖层能成功捕获CV-I，使得显色成功。这也解释了为什么结晶紫非常适合染色，而其他染料达不到类似的效果(在肽聚糖中迁移速率不同)。
当然，新机制的提出并不否定革兰氏染色的成功应用，相反可为染色效能的提高提供有益参考。
图4 革兰氏染色经典机制(上)与新机制(下)
参考文献
Gram, H. C. (1884) über die isolierte f?rbung der schizomyceten in schnitt- und trockenpr?paraten. Fortschr. Med. 2, 185–189
Davies, J. A., and Anderson, G. K. (1983) Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the stain. J. Bacteriol. 156, 837–845
Beveridge, T. J., and Davies, J. A. (1983) Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain. J. Bacteriol. 156, 846–858
Wilhelm, M.J., Sheffield, J.B., Sharifian Gh, M., et al. (2015) Gram’s stain does not cross the bacterial cytoplasmic membrane. ACS Chem. Biolo. 10(7), 1711-1717
结语：尽信书不如无书，要敢于质疑权威。
水平有限，必有不对之处，欢迎批评。
文章均为原创，转载请注明出处。
